多年來，寡核苷酸的合成方法發展歷程：，從 Michelson和Todd 早期的H-膦酸酯和磷酸三酯法[1]，以及Khorana在 1950 年代的磷酸二酯法[2]，再到1960年代磷酸三酯法的重新研究和1970年代的亞磷酸三酯法[3]。這些方法中的每一種都存在其弊端。亞磷酰胺法由Marvin Caruthers在1980年代初期開創，并通過固相技術和自動化的應用得到加強，現已成為首選方法。
亞磷酰胺法
亞磷酰胺寡核苷酸的合成沿3'至5'方向進行（與DNA 復制中生物合成的5'至3'方向相反）。每個合成周期添加一個核苷酸[4]。
圖1.亞磷酰胺寡核苷酸合成循環
DNA合成的亞磷酰胺單體主要由堿基、脫氧核糖、5'端的DMT和3'端的2-氰乙基以及二異丙基胺基組成。此外，由于腺嘌呤、胞嘧啶和鳥嘌呤和一些人工堿基存在伯氨基，因此也需要在單元中用適當的保護基團對其保護。在寡核苷酸合成之前必須從載體結合的核苷中脫去DMT保護基團。
步驟1：活化和偶聯
在進行偶聯之前，活化劑四唑提供一個質子給亞磷酰胺單體3'磷酸上二異丙胺基的氮原子，質子化的二異丙胺是一個良好的離去基團，與四唑形成亞磷酰胺四唑這種活性中間體，這個過程被稱為活化。脫保護的5'端-OH會與亞磷酰胺四唑活性中間體偶聯，形成新的磷氧鍵，并脫去四唑。在這一步核苷酸鏈得到延伸，需要注意的是：單體及活化劑中水分超標導致偶聯效率低，原料中雜質較多也會導致偶聯效率低。
圖2.亞磷酰胺偶聯反應機理
核苷亞磷酰胺在惰性氣體氛圍中相當穩定，可以用于制備與運輸，并可以在使用前以干燥固體形式儲存數月。只有在質子化作用時，核苷亞磷酰胺才具有反應性。
步驟2：加帽
在每個偶聯步驟中使用大大過量的四唑和亞磷酰胺單體可以將每一步偶聯的效率提高到99.5%以上，但即使使用最有效的化學方法和純度最高的試劑，也不可能實現100%的核苷都參與反應。這意味著核苷酸上會有一些未反應的 5'-羥基；如果不加以控制，這些 5'-羥基將可用于參與下一個偶聯步驟，并與引入的亞磷酰胺反應，導致得到的寡核苷酸會缺少一個堿基，并且對應于所需寡核苷酸的缺失突變。如果不檢查這種缺失突變，它們會隨著每個連續的循環而累積，最終產物將是寡核苷酸的復雜混合物，其中大部分將攜帶不正確的遺傳信息，并且難以純化。這還會導致后續生化實驗的失敗。
圖3.正確寡核苷酸的缺失突變序列（上）；和一個包含缺失突變的失敗序列（下），對應于第 6 位胸腺嘧啶堿基的缺失。
通過在偶聯反應后引入“加帽”步驟來避免缺失突變，以阻斷未反應的5'端-OH。合成器上使用了兩種封端溶液：乙酸酐和N-甲基咪唑 (NMI)。這兩種試劑（溶解在四氫呋喃中并添加少量吡啶）在輸送到合成柱之前在 DNA 合成儀混合。親電子混合物快速乙酰化，吡啶確保 pH 值保持堿性，以防止由乙酸酐與 NMI 反應形成的乙酸對核苷亞磷酰胺進行脫保護。 5'端-OH的乙酰化即可使它們對隨后的反應呈惰性。
圖4.亞磷酰胺寡核苷酸合成中加帽步驟的機理
步驟3：氧化
偶聯反應后新加上的核苷酸通過亞磷酯鍵（磷為三價）與寡核苷酸鏈相連，此亞磷酯鍵不穩定，易被酸、堿水解，因此需將此處三價磷氧化為五價的磷。被氧化后形成的磷酸二酯鍵實際上就是DNA鏈中的磷酸二酯鍵外加一個2-氰乙基保護，該保護基可以使磷酸二酯鍵在后續的合成中更穩定。這一步常用的氧化劑為碘的四氫呋喃溶液，此步反應速度亦很快。
圖5.亞磷酰胺寡核苷酸合成中氧化步驟的機理
在一些 DNA 合成儀上，碘氧化后還有第二個加帽步驟。這樣做的目的是干燥磷酸酯，因為氧化混合物中的殘留水會持續存在并抑制下一次偶聯反應。過量的水與酰化劑反應形成乙酸，該乙酸會在THF/吡啶溶劑混合物中被除去。
步驟4：脫保護
在磷酰胺偶聯、封端和氧化后，必須脫去核苷酸5'端的DMT保護基，以便伯羥基可以與下一個核苷酸亞磷酰胺進行偶聯反應。在二氯甲烷中用三氯乙酸脫保護是快速且定量的。注意太濃縮的TCA溶液或太長的脫三苯甲基化時間會導致脫嘌呤，因而會降低最終寡核苷酸的總產率。裂解產生的DMT碳陽離子顯示橙色，它在495nm處有可見光吸收，可通過檢測其吸光度監測偶聯效率。
這一步結束后，延伸后的寡核苷酸鏈進入下一循環，然后不斷重復循環直至鏈延伸至所需長度。
參考文獻：
1. A. M. Michelson,Alexander R. Todd. Nucleotides part XXXII. Synthesis of a dithymidine dinucleotide containing a 3′: 5′-internucleotidic linkage[J]. Journal of the Chemical Society (Resumed),1955,0(0). https://doi.org/10.1039/JR9550002632
2. P. T. Gilham,H. G. Khorana. Studies on Polynucleotides. I. A New and General Method for the Chemical Synthesis of the C5’-C3’ Internucleotidic Linkage. Syntheses of Deoxyribo-dinucleotides1[J]. J. Am. Che m. Soc.,2002,80(23). https://doi.org/10.1021/ja01556a016
3. Reese Colin B..The chemical synthesis of oligo-and poly-nucleotides by the phosphotriester approach[J]. Tetrahedron,1978,34(21). https://doi.org/10.1016/0040-4020(78)87013-6
4. 4.Beaucage S.L.,Caruthers M.H.. Deoxynucleoside phosphoramidites
--A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis[J]. Tetrahedron Letters,1981,22(20). https://doi.org/ 10.1016/S0040-4039(01)90461-7